近日，美国哈佛医学院和波士顿儿童医院的研究人员利用一种新的基因编辑方法挽救了患有遗传性听力丧失的小鼠的听力，并在成功做到这一点的同时，没有产生任何明显的脱靶效应。相关研究结果已在线发表于《自然—医学》。
这种新的方法是将经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统改良优化的版本，能够更好地识别引起疾病的基因突变。这种精确的工具允许科学家们选择性地让一个称为Tmc1的听力基因的缺陷拷贝失活，同时让它的健康拷贝发挥功能，并且成功地在小鼠基因组的30亿个碱基中识别出Tmc1基因缺陷拷贝中单个错误的DNA碱基。
研究人员表示，这项研究代表了一个里程碑，因为它极大地提高了标准基因编辑技术的功效和安全性。论文通讯作者、哈佛医学院耳鼻喉科与神经病学教授Jeffrey Holt称，这为研究治疗一系列由基因的单个缺陷拷贝引起的遗传疾病的超定向方法打开了一扇大门。
双重识别克服挑战
这些“贝多芬小鼠”之所以接收新的基因编辑方法的治疗，是因为其具有相同的导致人类进行性听力丧失的基因突变。这些小鼠的标志性缺陷是Tmc1基因的DNA序列中存在一个不正确的碱基——碱基A替换碱基T，即单个碱基错误代表着正常听力和耳聋之间的差异。
中国科学院院士、遗传生物学家贺林告诉《中国科学报》，耳绒毛细胞具有传导听觉信号的功能，而Tmc1则起着维持耳绒毛细胞正常功能的重要作用。该等位基因发生突变，就会引起耳绒毛细胞逐渐退化和死亡，最终导致听力丧失。
要想保护“贝多芬小鼠”的听力，让Tmc1基因的突变拷贝失去功能或沉默，是最好的办法之一，但如何在不让健康的基因拷贝失去功能的情况下完成，充满了挑战。
经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统通过使用向导RNA（gRNA）来识别发生突变的靶DNA序列，一旦确定了靶DNA的位置，Cas9就会进行定向切割。由于人类大多数显性突变是单核苷酸突变，理想的基因编辑治疗是在不影响野生型等位基因的前提下，有效且选择性地修正这些显性突变。
贺林同时指出，DFNA36人细胞系就具有单核苷酸突变，特异性切除突变等位基因可以治愈耳聋，但单核苷酸突变很难识别，一般内切酶如SpCas9可导致多种错误切割。论文中也指出，SpCas9（化脓性链球菌Cas9）就能够耐受目标DNA与gRNA的7种错配，此外，一些Cas9酶中的前间区序列邻近基序（PAM）也可耐受与靶DNA的错配。
为了提高检测和破坏的准确性，研究人员利用特定设计的SaCas9（金黄色葡萄球菌Cas9复合物）和gRNA，可以产生特异性的PAM和标靶基因序列的双重精确识别，特别是利用PAM的特异性，可以选择性地切割导致听力丧失的Tmc1突变等位基因，同时不产生任何明显的脱靶，也不影响正常的等位基因功能，极大地提高了基因编辑技术的功效和安全性，为精确治疗由单个基因拷贝突变引起的显性遗传疾病奠定了基础。
“我们使用双重识别系统来提高精确度，这种方法在靶向突变基因方面产生了前所未有的识别水平和准确性。”哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所转化医学科学教授David Corey说。
基因编辑将成有力武器
遗传性耳聋的主要致病原因是由于决定耳聋的基因位点出现了异常的排序，使得正常表达机制出现了异常。贺林称，目前，已搞清楚或部分搞清楚的遗传性耳聋所涉及的基因就有上百种，这些异常往往要在特定环境的诱导下发生，比如在药物、事故、灾害、环境等因素的作用下。
“治疗遗传性耳聋的最大难点是基因出了问题，因此这些年发展起来的基因编辑为治愈遗传性耳聋提供了有力的武器和光明的前景。”贺林说。
在此次研究中，出生不久就接受基因编辑治疗的两个月小鼠，听力与健康小鼠几乎无差别，6个月的小鼠仍可保持对低频声音的正常听力，部分小鼠在接受治疗后的近一年里可保持稳定的听力。而在不干预的情况下，“贝多芬小鼠”1个月大时就开始降低对高频声音的反应，6个月左右完全失聪。
值得关注的是，DNA分析结果显示，基因编辑仅发生在具有Tmc1突变的小鼠内耳细胞中。在接受注射但没有突变的小鼠中没有检测到编辑变化，且没有听力损失，表明该基因编辑方法具有极高的精确度和安全性。
“针对等位基因的致聋突变，可通过基因编辑技术的双重特异性识别策略，显著提高基因编辑技术的功效、安全性和稳定性。”复旦大学生物医学研究院副教授张文对《中国科学报》点评道，这种方法可以特异性靶向单核苷酸突变的等位基因，不仅适用于Tmc1突变造成的遗传性耳聋患者，也有望治疗由单点基因突变而引起的另外15种遗传性耳聋，同样也有可能对五分之一的人类显性基因缺陷（3759种）进行识别和治疗。
“该研究为一系列遗传疾病的治疗打开了大门，只要是由基因单拷贝引起的遗传缺陷，都有可能在此基础上开发高特异的靶向治疗。”Holt认为，这将是真正的精准治疗。贺林和张文也纷纷对记者表示，这种高度特异和高度靶向的优化方法，为精确治疗由单个基因拷贝突变引起的显性遗传疾病奠定了基础，具有广泛应用前景，非常令人期待”。
不过，张文同时指出，国内对耳聋基因开展基因编辑治疗的例子尚不多见，但对眼睛失明和地中海贫血的基因编辑治疗正在进行一些尝试性工作。例如，中科院神经科学研究所研究员杨辉等人就提出了DNA单碱基编辑的问题和改进方法；北京大学生命科学学院教授魏文胜等人也提出新型的RNA单碱基编辑策略，改善了脱靶效应和安全性；中科院神经科学研究所研究员仇子龙等人还提出高效率的新型基因编辑具有解决遗传性致盲的潜力，这些研究都为将来的临床试验带来了更多的希望。
临床应用仍需慎重
实际上，基因编辑对于治疗人类疾病也只是迈出万里长征的第一步，研究人员提醒道，“特别是这样高精度的基因编辑疗法在用于人体之前，仍然还有许多研究工作要做。”
贺林等专家也指出，该方法虽然在小鼠模型和人细胞系上成功实现了基因编辑，并且能保持半年到一年的稳定功效，但在推广到临床试验之前，针对人体细胞或灵长类动物，增加时间和样本量进行毒性、功效稳定性试验，以及免疫原性的测试，也许是更为安全的策略。
据报道，俄罗斯科学家针对另一种缺陷基因GJB2，准备用编辑方法治疗婴儿先天性耳聋，但在贺林及张文看来，虽然该技术有一定可行性，但风险可能大于收益。他们认为，很多遗传疾病可以通过体外受精、筛选胚胎的方法来预防，不需要进行基因编辑。
另外，专家们还强调，即使将来会考虑对成年人甚至婴幼儿的可行性治疗，但进行人类胚胎的基因编辑目前应当极力避免或禁止。总之，基因编辑人类胚胎应极为谨慎，技术还有待进一步成熟，而且必须符合伦理要求。
“要把治疗遗传性耳聋高效向前推进，遗传检测、遗传咨询和遗传治疗（基因编辑）三者齐头并进，将是最终取胜的法宝。”贺林强调说。
