北京时间11月23日凌晨，2020年合成生物学领域国际顶尖赛事——国际基因工程机器大赛（International Genetically Engineered Machine Competition，以下简称为iGEM）落下帷幕。疫情期间，此项赛事转为线上进行，吸引了来自麻省理工学院、清华大学、北京大学、上海交通大学等国内外知名学府的256支顶尖队伍参赛。我院代表队SJTU-BioX-Shanghai凭借项目“Rational Design Assisted Directed Evolution of CRISPR-Cas9 System on Specific Gene”获得银奖。
SJTU-BioX-Shanghai克服了疫情带来的重重困难，秉持坚定的意志圆满完成了比赛。今年的参赛项目在去年项目的基础上，继续运用合成生物学方法，针对2020年获诺奖技术CRISPR技术的瓶颈——脱靶问题，提出了从根源上解决基因编辑技术风险问题的优化方法。队伍从脱靶水平的测定，定向进化与理性设计三部分实现优化。
项目设计简要流程图
为了使脱靶和上靶水平可视化，SJTU-BioX-Shanghai设计了两套表征系统：CRISPRa和CRISPRi，利用Cas9蛋白激活或阻碍报告基因的表达。CRISPRa和CRISPRi系统包括两个部分：融合ω亚基和sgRNA的dCas9蛋白以及报告作用的荧光蛋白。经过比较验证，该支队伍最终选择利用CRISPRi系统对突变的dCas9蛋白进行评估和筛选。在CRISPRi系统中，目标序列和诱饵序列位于由阿拉伯糖启动子与核糖体结合位点之间。当dCas9与靶基因结合时，产生的空间位阻会阻断转录进行，从而抑制下游报告基因的表达，成功实现从脱靶效应到荧光强度测定的转换。
CRISPRi系统回路示意图
项目的核心在于定向进化和理性设计。在CRISPRi系统回路的基础上，SJTU-BioX-Shanghai队伍通过易错PCR的方法构建了突变体库，利用流式细胞仪对突变体文库进行筛选，并且进行DNA改组以积累突变体优势，最大化利用突变体文库。
非理性设计后的突变体文库
在理性设计部分，SJTU-BioX-Shanghai队伍选用多种模型进行实验预测，参考机器学习方法与神经网络构建方法，预测出多条可能与脱靶问题直接相关的序列，并在后续的实验验证中得到了显著的阳性结果，最终开发了PROMARE蛋白质设计软件。
PROMARE三大应用模块：特征提取，突变和设计
理性设计突变后dCas9脱靶率降低
项目立题角度新颖，可行性强，与基因编辑前沿热点联系紧密，同时利用理性设计方法进一步完善了定向进化系统的操作方法，为蛋白进化和技术改进提供了具有启发性的研究思路，具有广阔的应用场景，如：针对不同的基因编辑目标序列以及诱饵序列设计不同的luCas9蛋白；在掌握蛋白质晶体结构的情况下，利用蛋白质理性设计，加速定向进化；基于蛋白质结构和量子力学计算，使用理性设计和定向进化来优化酶的稳定性和反应性，进而达到从头设计的目的。
另外，今年的项目依然贯彻了将合成生物学进一步推广的理念，在线上线下开展了多个学术分享讲座；同时在微信公众号SJTUBioXShanghai上同步更新了多篇文献解读，为学术科研提供便利，也为年轻学子入门提供帮助。
科普推送
SJTU-BioX-Shanghai团队依托于Bio-X研究院“合成基因机器学生科技创新工作室”，指导老师为贺林院士、马钢副教授和王毓舒老师，2020年团队由来自生命科学技术学院的李可依、陈子瑶、冯宸煦、方震、刘江影、吴玥汀、杨盈泉、张昱朦、郑皓天、钟博子韬，药学院李君妍，农业与生物学院邹霭萱，致远学院何月、洪菲阳、田明振、温馨兰，电子信息与电气工程学院余达龙，生物医学工程学院朱迪等18名学生组成。往届队员何沛祥担任技术指导，生命科学技术学院肖毅教授担任团队顾问。
