2024年7月16日，上海交通大学Bio-X研究院的马钢研究团队在生物质能源TOP期刊Biotechnology for Biofuels and Bioproducts上发表题为“Engineering cyanobacteria as a new platform for producing taxol precursors directly from carbon dioxide”的研究论文，报道了在光合微生物蓝藻中构建和优化异源紫杉醇生物合成途径，利用蓝藻的光合作用能力，将二氧化碳转化为具有高附加值的紫杉醇前体的工作。同时，转录组学分析在一定程度上提示了导入异源细胞色素P450氧化酶促进蓝藻萜类生物合成效率的机制，为搭建萜类化合物的高效光合细胞工厂提供了新的思路。
紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是一种高效的天然抗肿瘤药物，对乳腺癌、卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤具有显著的治疗效果。尽管紫杉醇的发现和应用为癌症治疗带来了革命性的进展，但其生产过程仍面临着诸多挑战。目前，紫杉醇的生产主要依赖于从红豆杉属植物中提取以及半化学合成，然而，这些方法存在依赖自然资源、成本高昂和环境可持续性等问题。随着合成生物学的发展，研究人员曾在多种模式微生物中实现了紫杉醇前体的从头合成，例如大肠杆菌和酿酒酵母，但由于这类异养微生物中缺乏有效的氧化酶系统，尤其是细胞色素P450氧化酶的活性受限，导致紫杉醇的全生物合成过程面临巨大挑战。
蓝藻作为一种光自养型微生物，具有将太阳能和二氧化碳直接转化为有机物质的能力，被认为是一种极具潜力的生物合成平台。蓝藻不仅能够合成各种光合色素，如类胡萝卜素、叶绿素等，而且其内源的甲基赤藓醇4-磷酸途径（Methylerythritol phosphate, MEP）能够提供充足的二萜前体，有利于萜类化合物的生产。此外，蓝藻中的光合电子传递链能够为P450酶的活性提供必需的还原力。最重要的是，蓝藻内源的类囊体膜能够为真核来源的P450酶提供表达场所，使蓝藻成为表达异源P450酶的最适微生物底盘。
图1 在蓝藻中构建紫杉醇合成途径的示意图
图2 在高密度培养模式下工程菌DIGT能够合成2.94 mg/L的紫杉二烯
实现紫杉醇前体生物合成的关键一步是建立有效的细胞色素P450酶依赖的氧化途径。为此，作者首先将完整的紫杉烷5α-羟化酶（T5αH）及其还原酶（CPR）的基因序列导入到高产紫杉二烯的菌株DIGT中，这两个酶介导紫杉二烯C5位的羟基化反应，也是紫杉二烯所有羟基化反应的第一步，这一步将生成关键中间体5α-羟基-紫杉二烯。为了提高这些异源蛋白的表达效率，作者对编码序列进行了密码子优化。同时，通过调节启动子强度和RBS组合等策略，作者对T5αH和CPR的表达进行了优化调控，以探究T5αH和CPR在紫杉二烯氧化中的作用。在五种下游工程菌中，均检测到包括5α-羟基-紫杉二烯在内的一系列氧化紫杉烷产物，其中，使用超强启动子Pcpc560的工程菌DIGT-P560获得最高的氧化紫杉烷产物（17.43 mg/L），其中5α-羟基-紫杉二烯的滴度为4.32 mg/L，占到氧化总产物的25%。
图3 对P450酶及其还原酶进行组合优化以提高氧化紫杉烷的产量
尽管从产量上看，用蓝藻合成氧化紫杉烷的效率似乎远不及大肠杆菌和酵母系统，但是作者观察到一个与众不同的现象，在蓝藻中氧化紫杉烷的滴度要显著高于其前体紫杉二烯，似乎异源P450酶的引入在一定程度上能够促进萜类产物的合成。为了探究其中的机制，作者对紫杉二烯合成菌株DIGT和氧化紫杉烷合成菌株DIGT-P560进行了RNA高通量测序，通过转录组学分析，发现异源P450酶的导入确实干扰了蓝藻的光合系统和能量代谢，但同时也激活了某些基因，特别是与TCA循环相关的基因，这有助于提供更多的底物给MEP途径，增加GGPP池，从而提高二萜化合物的合成效率。多个NAD合成基因的上调表达也暗示了DIGT- P560可能通过增强电子传递速率和调节NAD+/NADP+比例来维持P450酶的高活性，而紫杉二烯的高转化率能够促进产物的更高效合成。尽管紫杉醇的异源生物全合成之路任重道远，这项工作展示了蓝藻作为底盘细胞去重建紫杉醇合成途径的巨大潜力，并为开发高效光合细胞工厂奠定了坚实的理论基础。
图4 下游菌株DIGT-P560中的基因转录水平变化
上海交通大学Bio-X研究院博士研究生钟佳琳和王毓舒老师为该论文的共同第一作者，马钢副研究员为通讯作者。此外，特别感谢上海交通大学生命科学技术学院特聘教授刘天罡对该工作的大力支持与帮助。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学青年基金、上海市自然科学基金的资助。
文章链接：https://doi.org/10.1186/s13068-024-02555-9
